Le réactif de Sanger est utilisé pour aider à déterminer la séquence d'acides aminés qui constituent un peptide. Le réactif se verrouille sur - ou tag - l'acide aminé à la fin d'une chaîne de peptide, également connu sous le N-terminus. Le peptide peut alors être cassé en morceaux (hydrolysées) et les acides aminés individuels examinés en utilisant diverses méthodes de chromatographie. Quelle que soit l'acide aminé porte l'étiquette est celle de la fin. Le réactif de Sanger est également connu comme dinitrofluorobenzène (DNFB). Une fois qu'il a verrouillé sur un acide aminé, il est désigné sous le nom de DNP-composé.
Peser 3 milligrammes de peptide sur une échelle. Les placer dans un tube de centrifugation. Ajouter environ 0,3 ml d'eau, 0,3 ml de réactif de Sanger et 0,075 ml de bicarbonate de sodium.
Laisser le tube de centrifugation à incuber à la température ambiante pendant une heure. Pendant l'incubation, secouez doucement le tube pour empêcher le mélange de se séparer. Vérifier le pH de la solution toutes les 15 minutes avec du papier pH. Le pH doit être maintenu au-dessus de 9. Si elle commence à chuter, ajouter une petite quantité de bicarbonate de sodium (environ une goutte à la pipette Pasteur).
Après l'incubation, ajouter 1,5 ml d'eau et une quantité égale d'éther. Laisser la solution se séparer en couches. Vous pourriez avoir à centrifuger le mélange à séparer. Retirer la couche d'éther (le haut, couche jaune) avec une pipette et le jeter.
Ajustez le pH à 1,0 en ajoutant lentement de l'acide chlorhydrique. Ajouter un peu d'acide à la fois, remuer doucement, puis vérifier le pH avec du papier pH. Au total, il devrait exiger environ 0,15 ml d'acide. Si le pH descend en dessous de 1,0, ajouter une petite quantité (pas plus d'une chute) de bicarbonate de sodium.
Ajouter 3 ml d'éther. On laisse le mélange se séparer. Maintenant, la couche supérieure (le, de couche d'éther jaune) contient votre DNP-composé. En utilisant une pipette, extraire soigneusement cette couche et le transférer dans un tube à essai propre. Placez le tube à essai de côté et laisser le liquide à évaporer, laissant derrière lui un endroit sec, solide jaune.
Lavez votre solide avec de l'acétone. Ajouter 0,3 millilitres d'acétone, remuer délicatement et extraire le liquide avec une pipette. Ajouter 0,75 millilitres d'acide dans le tube d'essai. Votre peptide est maintenant étiqueté et prêt à être hydrolysée et analysée avec la méthode de chromatographie de votre choix.